Tipos de microscopios de fluorescencia
Cuando los microscopios fueron inventados hacia 1600 CE , los filósofos naturales volvieron sus ojos a un mundo dentro de otro mundo . Cuando Antony van Leeuwenhoek elaborado pequeñas lentes, curvas altamente y un soporte mecánico para ajustar la vista , abrió una ventana al mundo microscópico de las bacterias, las células sanguíneas , protozoos y la estructura celular de las plantas. Pero a lo largo de la historia de la microscopía , siempre ha habido una sola pregunta: ¿Cuáles son esas cosas extrañas vistas a través de un lente? Microscopía de fluorescencia se refiere a un conjunto de técnicas que minimiza la incertidumbre - ya que en microscopía de fluorescencia cuando la luz se brilla en una muestra , que brilla con luz propia la derecha de nuevo . Epifluorescencia
microscopios Epifluorescencia brillan y recoger la luz a través de la misma óptica .
Con mucho, el microscopio de fluorescencia más común es la configuración de epifluorescencia . En un microscopio de epifluorescencia , una fuente de luz - típicamente una lámpara de mercurio o xenón - brilla a través de un filtro que selecciona una región estrecha de longitudes de onda . La luz filtrada brilla sobre la muestra a través de la lente del objetivo de microscopio . La luz incidente es absorbida por fluoróforos - las etiquetas moleculares que emiten luz de una longitud de onda larga cuando absorben luz de una longitud de onda más corta. La luz de los fluoróforos , junto con la luz dispersada de la fuente de iluminación , se remonta a la lente objetivo y el detector o los ojos. En el camino, otro filtro bloquea la luz de iluminación , por lo que todo lo que queda es la luz fluorescente de la muestra.
Confocal
Un microscopio de epifluorescencia recoge la luz de en todas partes dentro del campo de visión del microscopio . Algunos de la luz de excitación se absorbe antes de que el plano focal del microscopio , algunos en el plano focal y algunos más allá del plano focal . Debido a que el microscopio recoge toda esa luz, la imagen contendrá una imagen nítida de la luz en el foco , sino que también tendrá la luz fuera de foco de otras regiones. Un microscopio confocal fija que, al centrarse un punto de láser en el mismo plano que el microscopio se enfoca . Entonces , un agujero de alfiler va delante del detector, donde bloquea toda la luz que no viene desde el enfoque del microscopio. Mediante la exploración de la muestra, una imagen tridimensional limpia del objeto se puede obtener .
Multifotónica la Venta en un microscopio de fluorescencia a la luz proviene de las moléculas dentro de la muestra .
En un microscopio confocal de la alineación es muy sensible . Si el punto de láser , el objetivo del microscopio , la óptica y la recolección del agujero de alfiler están apagados incluso la cantidad más el rendimiento microscopio sufre. Un microscopio multifotónica evita este problema mediante el uso de una longitud de onda de láser que es sólo la mitad de energía , ya que tiene que ser para excitar los fluoróforos en la muestra. La única forma en que los fluoróforos se van a entusiasmar y emitir fluorescencia es si la luz láser es lo suficientemente brillante como para que dos partículas de luz - fotones - golpean el fluoróforo en un tiempo muy corto. Eso sólo ocurre cuando el láser se enfoca a un muy pequeño punto . Así que el único lugar en la muestra que va a emitir luz es donde el láser es enfocado , lo que mantiene la imagen agradable y limpio , porque no hay luz de fondo extra para deshacerse de - . Que significa que no hay agujero de alfiler para alinear
la fluorescencia de reflexión interna total
( TIRF )
Una sola muestra puede tener múltiples fluoróforos .
Otra forma de obtener imágenes muy limpias es asegurarse de que la luz de excitación no llega muy lejos en la muestra. Si una gota de neuronas , por ejemplo , se coloca en una gota de solución en un portaobjetos de vidrio , a continuación, algunas de las neuronas se adherirá a la superficie de vidrio . En un total de fluorescencia de reflexión interna ( TIRF ) Microscopio de la luz se dirige hacia los lados en el portaobjetos de vidrio por lo que no tiene mucho en la solución de la celebración de las células. Pero algo de la luz apenas se filtra en la solución - sólo muy cerca de la superficie del vidrio . Esto significa que los únicos lugares que emitirá luz estará en una región muy delgada hasta en contra de la superficie del vidrio . Por algo así como las neuronas , donde tantas cosas interesante sucede en la superficie de las células , esta técnica puede ser muy eficaz
Super- Resolución
Todos los microscopios . - incluyendo microscopios de fluorescencia - están limitados por la física que gobierna la propagación de la luz . Una de las reglas básicas es que un punto de luz enfocado sólo puede ser tan pequeña - y no menor . Para la luz visible , que el tamaño es de unos 200 nanómetros , o 200 millonésimas de un metro . Pero las moléculas individuales son sólo unos pocos nanómetros de tamaño , por lo que hay un montón de características interesantes que están por debajo de ese límite de tamaño , llamados el límite de difracción . Los científicos están desarrollando técnicas de " super- resolución" de colarse en torno a ese límite. Microscopía iluminación estructurada (SIM ) y estimulado el agotamiento de las emisiones ( STED ) microscopía , por ejemplo, son dos métodos de microscopía de fluorescencia que limitan el tamaño del haz de luz que emiten por la reducción del tamaño del haz de luz de excitación.